T.R. Knight è nato e cresciuto a Minneapolis, Minnesota, nel 1973. Ha svolto la maggior parte del suo lavoro a teatro, ed è stato membro della compagnia teatrale Minneapolis' Guthrie Theater, con la quale ha interpretato numerosi ruoli. Il suo primo ruolo è stato quello di un bambino di 5 anni Tiny Tim in A Christmas Carol. Una volta trasferitosi a New York ha interpretato anche Tim Allgood in Noises Off, Damis in Tartuffe, Joe in This Lime Tree Bower e Brendan Hilliard in Anto Scattergood.
Ha ricevuto una nomination ai Drama Desk come Miglior attore non protagonista in una rappresentazione teatrale per il suo operato in Scattergood.
Vive tra New York City e Minneaplois.